葉綠素a校準方法

關(guān)于Hydrolab葉綠素、藍藻探頭測量準確程度的說明

摘要：

      本文針對Hydrolab多參數(shù)水質(zhì)分析儀的葉綠素和藍藻探頭的原理做了介紹，并對熒光法和實驗室標準測量方法進行了簡單對比，指明了儀器測量值與實驗室分析值之間的差異來源，探討了影響實際在線監(jiān)測中的影響因素，并提出一些改善數(shù)據(jù)質(zhì)量的辦法。

0、引言

       Hydrolab由于可以測量葉綠素和藍藻，可以針對水華現(xiàn)象做出有效預(yù)警，在地表水、源水領(lǐng)域有很多應(yīng)用。環(huán)保部門、水利部門以及各地水司、水廠都可以使用該產(chǎn)品對目標水域（主要是湖泊、水庫）進行葉綠素和藍藻的便攜測量。但由于對探頭測量技術(shù)的不熟悉，許多使用者對于該探頭的測量精度有誤解，使用中也出現(xiàn)了一些問題，造成用戶對于探頭的準確度產(chǎn)生了懷疑。在此特別針對兩個探頭的測量技術(shù)及實際應(yīng)用中容易產(chǎn)生的問題做出說明。

1、探頭的測量原理

葉綠素和藍藻探頭是基于色素的熒光性測量目標參數(shù)的。色素在光譜中有吸收峰和發(fā)射峰，利用這一特性，在葉綠素的光譜吸收峰（波長460 nm）發(fā)射單色光照射到水中，水中的葉綠素吸收單色光的能量，釋放出另外一種波長（發(fā)射峰，波長685 nm）的單色光，葉綠素發(fā)射的光強與水中葉綠素的含量成正比。

葉綠素、藍藻探頭檢測原理圖

藍藻的測量原理同葉綠素a類似，在淡水中測量藻藍素（藻藍蛋白，吸收峰590 nm，發(fā)射峰650 nm），海水中測量藻紅素（藻紅蛋白，吸收峰530 nm，發(fā)射峰570 nm）。

2、探頭的校準

       這種熒光法測量色素在探頭量程內(nèi)具有很好的線性度，如下圖所示是藍藻探頭針對不同藻類測量得到的曲線。由于葉綠素和藍藻在不同的藻類中含量差別較大，而探頭本身是測量熒光強度的，那么就需要把水中葉綠素和藍藻的含量與探頭測得的熒光強度進行對應(yīng)，這就是通常的校準過程。

校準時需要從水中提取水樣并固定，采用實驗室方法對水樣中的葉綠素（藻密度）進行分析，然后把探頭放到水樣中，用實驗室分析得到的讀數(shù)校準儀器。這樣，探頭測得的熒光強度就和水中的葉綠素（藍藻）濃度形成了對應(yīng)關(guān)系?？梢灾苯佑锰筋^測量水中葉綠素（藍藻）的濃度。

不同藻類的藻密度與熒光強度的線性關(guān)系

由于實驗室測葉綠素（藍藻）比較復(fù)雜，有些實驗室可能不具備檢測條件，因此，可配備二次校準模塊對葉綠素（藍藻）探頭進行定期校正。二次校準模塊是一個光學模塊，可以記錄探頭的光學特性，在對葉綠素（藍藻）進行實驗室首次校準后，可以用二次校準模塊記錄校準號的探頭參數(shù)，然后定期使用二次校準模塊將探頭參數(shù)寫回原始探頭。一個二次校準模塊只能用于一個探頭。

3、與實驗室方法的對比

       熒光法探頭測量葉綠素和藍藻對比實驗室分析方法而言，具有速度快、操作簡單等特點，尤其適合長期在水中在線測量，以反映水中葉綠素和藍藻的變化趨勢。

       但水中葉綠素和藻類分布很不均勻，距離很近的采樣點可能葉綠素和藻類濃度相差很多，同一地點不同深度的水體也有很大差異，而探頭的尺寸很小，光源和檢測窗口的尺寸都只有幾個毫米，能夠檢測到的水體只有探頭前面附近的水體，因此探頭所測得的實際上是相應(yīng)物質(zhì)在探頭所在位置的點濃度，而這一點濃度也是隨著水流而不斷變化的。除此以外，由于探頭檢測尺寸很小，隨著水流、魚類運動給探頭附近帶來的氣泡、雜質(zhì)等都會對探頭的測量產(chǎn)生影響。因此，在使用時，要根據(jù)探頭的這一測量特點，采用多點測量，同一點多次測量的方式，盡量減小由于外界因素（如氣泡、懸浮物等）給探頭帶來的影響，在多次測量的結(jié)果中去掉壞點，再做平均處理，即可得到比較準確的數(shù)據(jù)。

       對于藍藻而言，由于實驗室測量誤差很高，約在20%左右，因此，藍藻探頭也無法得到十分精確的校準。同時，水中藍藻的種類很多，不同藻類所含的藻藍素含量也不同，而藍藻探頭實際上是測水中的藻藍素含量而不能區(qū)分藍藻的種類，因此，探頭無法得到十分準確的藻細胞個數(shù)。通常只和實驗室方法做量級上的對應(yīng)。

4、熒光法探頭穩(wěn)定性和精度的說明

       在進行實驗室的對比試驗時，有時會發(fā)生葉綠素或藻類讀數(shù)不穩(wěn)定的情況。這是因為即便是把水樣保存在采樣瓶或者儀器的校準杯內(nèi)，水中的藻類分布仍然是不均勻的。由于葉綠素是蘊含在藻類中的，而藻類在水中的分布具有不均勻性（藻類會在水中游動，分布也根據(jù)藻類性質(zhì)的不同有離散或抱團的情況），因此水中的葉綠素和藻類的分布在時間和空間上都具有不均勻性。反映到探頭的讀數(shù)中，就會發(fā)現(xiàn)探頭讀數(shù)在一定范圍內(nèi)變化，這是正?，F(xiàn)象，所有以在線熒光法作為檢測方法的設(shè)備都是這樣的。這與實驗室的葉綠素方法有本質(zhì)上的區(qū)別，在實驗室方法中，要把水樣中的葉綠素全部萃取出來分析，這樣得到的實際上是水體中葉綠素的平均濃度，而這一平均濃度是不能從實際水樣中直接得到的。基于上述原因，我們?yōu)榱伺懦捎谌~綠素和藻類分布不均勻造成的探頭讀數(shù)不穩(wěn)定的影響，通常在測量前將水樣搖勻，并觀測多個數(shù)據(jù)取其平均值。（此時要考慮濁度帶來的影響，詳見下述）

       探頭的標稱精度為3%，這是指探頭測熒光光強的精度為3%，如果水中的響應(yīng)色素均勻分布，那么我們可以認為，此時探頭測量相應(yīng)色素的精度為3%，但由于上述色素分布的不均勻性，實際使用中，對應(yīng)的葉綠素和藍藻的測量精度要低于3%。

5、濁度給熒光法探頭帶來的影響

       濁度對葉綠素讀數(shù)主要有兩種影響：

1.由于光散射增強，空白值會升高。

2.由于光吸收效應(yīng)，導(dǎo)致熒光值降低。

濁度對熒光值影響的程度主要取決于其濃度水平，可變性和造成濁度環(huán)境的混合物成分。輕微、均勻的濁度對活體葉綠素只有微弱影響，但高水平、變化的濁度可顯著引起讀數(shù)誤差。一般而言，濁度在50NTU以下不會對探頭的讀數(shù)造成顯著影響，可以忽略，但如果水體的濁度在50NTU以上，則需要使用公式對探頭的讀數(shù)進行修正，具體公式見附錄，在此不做詳述。

6、用質(zhì)控的辦法提高測量精度

       對于使用熒光法原理的葉綠素和探頭來說，想要提高讀數(shù)的穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)質(zhì)量有以下幾種辦法。

       1、根據(jù)現(xiàn)場的實際情況做好探頭的維護和保養(yǎng)工作。探頭的光學窗口面積狹小，在水中很容易被氣泡、污泥以及微生物覆蓋，導(dǎo)致探頭測量不正確甚至無法測量的情況發(fā)生，因此，必須對探頭加以保護，如加裝銅網(wǎng)等保護裝置，使探頭盡可能少的受到污染。同時DS5X主機本身具有自清洗功能，應(yīng)合理設(shè)置主機，使其在測量前的1-2分鐘能夠自動清洗探頭表面，該清洗刷最多可以在測量前反復(fù)清洗探頭9次。此外，定期的探頭清理工作也是必須的。

       2、利用多次測量的平均值使曲線更加平滑且穩(wěn)定。由于探頭測量的始終是“瞬時點濃度”，為了能讓這個濃度值和實際的實驗室測得的平均濃度相匹配，可以采用讓儀器多次測量取平均值的辦法近似的得到穩(wěn)定性更好的平均濃度值來代替非典型的瞬時點濃度值。

       3、利用質(zhì)控的辦法，建立參數(shù)的二元回歸質(zhì)控模型，在模型中可以引入實驗室測量值、濁度測量值和當前值，利用該模型，對數(shù)據(jù)進行軟處理，使之更加符合實驗室的分析結(jié)果。模型的具體建立辦法見附錄。

7、熒光法測量葉綠素和藍藻的前景

       利用熒光法進行色素的測量是一種比較新的方法，目前主要用來測量水中的葉綠素、藍藻中的藻藍蛋白和藻紅蛋白等少數(shù)幾種色素，隨著熒光技術(shù)的不斷成熟，更多可測量的色素也會逐漸引入，使得我們可以通過不同色素的含量區(qū)分水中的不同藻類，如藍藻、綠藻、褐藻等（目前也有類似的辦法，但是還不是很完善）。除此以外，對于熒光法用于現(xiàn)場測量的穩(wěn)定性以及影響因素、如濁度等，也可以通過技術(shù)手段不斷完善，如在探頭中增加濁度補償，改善熒光光源和檢測器的靈敏度以得到更好的數(shù)據(jù)質(zhì)量等。

8、總結(jié)

       根據(jù)目前的使用情況，熒光法的葉綠素和藍藻探頭可以有效的對源水水質(zhì)進行在線監(jiān)測預(yù)警，每秒一個讀數(shù)的極大優(yōu)勢可以使監(jiān)測者對于水中的藻類生長情況一目了然，根據(jù)葉綠素和藍藻濃度的變化趨勢對可能出現(xiàn)的水華做出預(yù)警，才去措施消除隱患。但在測量精度方面，葉綠素探頭的精度相對較好，在多點測量和多次測量的基礎(chǔ)上可以得到比較準確的葉綠素平均濃度，而藍藻探頭一般只和實驗室方法做量級上的對應(yīng)。